SP8 FALCON-即時產生熒光壽命成像（FLIM）
我們經常聽到別人抱怨熒光壽命測量：“壽命分析太復雜了！"但這種情況即將改變！新技術和新概念的發(fā)展促進了數(shù)據(jù)評估，意味著熒光壽命成像(FLIM)的速度提高了10倍，可以媲美標準共聚焦成像，且操作簡單。
圖為小鼠胚胎的壽命圖像。722個視野拼接，擬合出4個獨立的特征壽命。采集時間約1小時-傳統(tǒng)方法約1天。

熒光成像遠超您的想象！
熒光過程提供了兩個用于成像的測量參數(shù)：強度和熒光壽命。熒光壽命是指分子停留在激發(fā)態(tài)的時間。可以通過觀察足夠大量的激發(fā)-發(fā)射事件集合來測量熒光染料的典型壽命。我們可以測量圖像中所有像素的典型壽命，并將這些數(shù)字記入數(shù)組元素。那就是熒光壽命成像[1](FLIM，也稱為τ-映射）。典型的熒光壽命范圍在0.2到20納秒之間。
熒光壽命與熒光染料的濃度無關。無論樣品結構僅有零星熒光染料還是載滿熒光染料：壽命信號始終相同，并表明在同一環(huán)境中存在相同的熒光染料。因此，熒光壽命不受光漂白的影響。樣品深處的圖像將比表面圖像暗得多——但壽命并沒有改變。這是壽命測定的主要優(yōu)勢。
如果分子環(huán)境刺激激發(fā)態(tài)衰變而不發(fā)射光子，則熒光強度會降低（淬滅）。熒光淬滅是一條單獨的發(fā)射路徑，因此在動力學上與熒光過程形成競爭關系。激發(fā)態(tài)存儲現(xiàn)在可以通過一個以上的過程衰變，從而縮短熒光壽命。這種壽命的改變可用于收集分子環(huán)境的信息。
一種特殊類型的淬滅是將激發(fā)能量以非輻射的方式傳遞到相鄰的不同熒光染料中：“熒光共振能量轉移"[2]，F(xiàn)RET。此時，不僅第一個熒光染料（供體）變暗，壽命變短，而且第二個熒光染料（受體）在“錯誤的"激發(fā)顏色下開始發(fā)光。由于這種效果的產生需要兩種熒光染料（小于10 nm）的密切接觸，因此將其用作研究分子相互作用的“分子標尺"。它也是許多現(xiàn)代FRET生物傳感器的基礎，專門用于測量活體樣本中的各種細胞內參數(shù)：Ca2+或其他離子濃度追蹤、酸堿度、極性和電位測量、蛋白質相互作用等。
FLIM-標準
FLIM的黃金標準是“時間相關單光子計數(shù)"[3]TCSPC，它與多光子共聚焦顯微鏡兼容。用光脈沖照射樣本，測量發(fā)射光子到達的時間。為重建典型的壽命，這種測量要在同一樣本位置重復幾次。需要測量幾百個事件才能達到大約10%的準確度。然后將數(shù)據(jù)按時間分組放入直方圖中。然后對該直方圖中隨時間出現(xiàn)的衰變進行數(shù)學擬合，并直接提供所需的熒光壽命（圖01a-c）。

 
圖01a：測量激光脈沖激發(fā)（藍色箭頭）后發(fā)射光子（紅色箭頭）的到達時間t?。此處繪制了5個測量值。

 
圖01b：到達時間的直方圖，包括上述示例中五個事件的集合。大多數(shù)計數(shù)#時間都很短。直方圖用指數(shù)衰減（紅色）來擬合。

 
圖01c：擬合顯示，例如，兩個單衰變（藍色和綠色曲線），衰變時間t?和t?，振幅為A?和A?。求和將再次獲得紅色衰變曲線。
這個過程是精確的，并可以重復，但需要一定時間。測量后，系統(tǒng)在大約100納秒的死區(qū)時間內準備好進行下一次發(fā)射。要錄入400個事件，測量一個像素的時間達40微秒。一張512x512的圖像大約需要12秒，這無法適應快速變化和移動的生命系統(tǒng)。
目前的解決方案需要一定的技術靈活性、復雜的手動數(shù)據(jù)處理和精密的評價程序。
新標準
徠卡顯微系統(tǒng)推出了一款新型FLIM顯微鏡：SP8 FALCON（FAst Lifetime CONtrast）熒光壽命成像系統(tǒng)可以解決以上所有問題。
本系統(tǒng)基于混合探測器（HyD）[4]，是理想的壽命成像傳感器，具有極短的死區(qū)時間。激光脈沖序列和發(fā)射光子脈沖都以高采樣率即刻實現(xiàn)數(shù)字化，將測得的距離直接輸入數(shù)據(jù)池。這些到達時間用于輸出“快速-FLIM"圖像。
新方法允許使用大多數(shù)激光脈沖，并應用一個過濾器來限制只有一個光子發(fā)射的脈沖事件。在第一個光子到達后不久，隨即到達的光子不可避免的會被忽略，可以通過智能數(shù)學方法進行校正。基于以上種種因素，圖像記錄速度提高了10倍。
所有FALCON FLIM成像均集成在共聚焦顯微鏡中。記錄FLIM就像激活一個額外的通道。用于3D、時間和光譜系列的多維采集模式可立即用于FLIM成像。例如標題圖像：具有經典組織學染色的小鼠胚胎。使用NAVIGATOR軟件，創(chuàng)建了722個圖塊，每個圖塊為512x512像素的圖稿。原始圖像有1.9億像素。用四個指數(shù)對壽命進行擬合，并以顏色進行編碼。
應用實例
在功能成像領域，我們希望監(jiān)測小分子、離子或電勢的動態(tài)變化。這通常是用熒光探針完成的。其中多數(shù)顯示出強度和壽命的變化。也可以用熒光蛋白裝飾蛋白質，并在活細胞中表達這些構建體。該技術利用FRET跟蹤活細胞中的分子相互作用。最為現(xiàn)代化的工具是蛋白質或肽，它們與所需的分析物（例如Ca2+）結合，并裝飾有一對進行FRET的熒光蛋白。結合分析物后，肽將發(fā)生構象變化，F(xiàn)RET將出現(xiàn)或消失。這些探針被稱為FRET-生物傳感器。生物傳感器的一種是利用cAMP結合蛋白Epac[5]

 
圖02：用游離態(tài)的cAMP刺激培養(yǎng)細胞，并用Epac FRET-生物傳感器進行監(jiān)測。在紅色圓圈區(qū)域分析信號（平均到達時間t?）。隨時間變化的圖示見底部。由K.Jalink，B.van den Broek，NKI Amsterdam(NL)提供。
SP8 FALCON的新技術速度夠快，可以在活細胞中使用化學傳感器和FRET生物傳感器進行熒光壽命成像。
無染色應用是分析活體材料中的內源性熒光。例如：癌細胞抑制細胞呼吸，傾向于無氧糖酵解(瓦博格效應)，這會導致積累更高濃度的熒光NADH_[6]。即使沒有活檢，多光子顯微鏡也能在皮膚組織中進行深度成像。同樣，壽命對比度要可靠得多，因為深層的顯微鏡會受到吸收和陰影效應的影響，從而使強度信號失真。
傳統(tǒng)意義上，不同的熒光染料以其不同的顏色來區(qū)分。如果激發(fā)和發(fā)射相同，仍然可以通過壽命進行區(qū)分。發(fā)射強度和壽命可以作為顏色的函數(shù)獨立記錄。因此，可見熒光染料的數(shù)量是發(fā)射光譜和擬合壽命的乘積。

 
圖03：lt-染料分離的原理證據(jù)（6個信號）。用480 nm激發(fā)云杉葉的新鮮切片，在兩個通道（頂部和底部行）中進行記錄，每個通道可分開顯示三個壽命（從左到右）。由Leica Microsystems的I.Steinmetz提供支持。
總結
徠卡顯微系統(tǒng)的SP8 FALCON（FAst Lifetime CONtrast）共聚焦和多光子顯微鏡匯集了所有這些新技術和新概念，生成FLIM技術，適用于多個應用領域。相較于傳統(tǒng)的TSCPS方法（時間相關單光子計數(shù)），圖像采集速度快了10倍，是迄今為止壽命成像的黃金標準。從而可以使用壽命對比來監(jiān)測活體樣本的運動學和動力學情況。
其直接實現(xiàn)和自動化使研究人員不再需要耗時于硬件調整和數(shù)據(jù)評估。3D堆疊、延時序列、鑲嵌掃描和激發(fā)或發(fā)射波長掃描等復雜的數(shù)據(jù)采集模式與FLIM技術無縫結合。

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