共焦顯微鏡在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡，將已經通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點上有一個帶有針孔的擋板，小孔就位于焦點處，擋板后面是一個光電倍增管。可以想像，探測光焦點前后的反射光通過這一套共焦系統，必不能聚焦到小孔上，會被擋板擋住。于是光度計測量的就是焦點處的反射光強度。

　　傳統的光學顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光束經照明針孔形成點光源對標本內焦平面的每一點掃描，標本上的被照射點，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點或逐線接收，迅速在計算機監視器屏幕上形成熒光圖像。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發射針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點。